物質學院季泉江課題組開發多重耐藥鮑曼不動桿菌基因組工程平臺

ON2019-10-08文章來源 物質科學與技術學院CATEGORY新聞

近日,物質學院季泉江課題組在知名期刊《細胞?化學生物學》(Cell Chemical Biology)發表了題為“A Highly Efficient CRISPR-Cas9-Based Genome Engineering Platform in Acinetobacter baumannii to Understand the H2O2-Sensing Mechanism of OxyR”的研究論文,首次在鮑曼不動桿菌中建立了高效的基因組編輯平臺。該平臺利用RecAb重組酶/CRISPR-Cas9及APOBEC1胞嘧啶脫氨酶,實現了對多種鮑曼不動桿菌菌株的精確基因刪除、插入、點突變及C→T轉變,并基于這些編輯方法探究了OxyR的活性氧感應機制及多重耐藥菌株XH386對亞胺培南和舒巴坦的耐藥機制。

近幾十年來抗生素廣泛使用,多重耐藥甚至全耐藥的超級細菌不斷出現,造成的病人嚴重感染及死亡病例與日俱增,對人類健康造成重大威脅。鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)是一種危害極大的人類病原菌,在世界衛生組織(WHO)于2017年發布的12種被列為最高優先級的超級細菌名單中位列榜首,強調了耐藥型鮑曼不動桿菌感染的嚴重性和開發新型治療方法的急迫性和重要性。新型治療方法的開發離不開使用遺傳操作方法對鮑曼不動桿菌的致病和耐藥機制進行解析,然而當前的鮑曼不動桿菌遺傳操作方法,如非復制許可質粒法和重組酶催化重組法等,較為費時和低效,難以實現精確的無痕編輯。

圖1.鮑曼不動桿菌中的pCasAb-pSGAb/RecAb基因組編輯平臺。

(A)pCasAb-pSGAb/RecAb的工作流程圖。(B,C)僅RecAb重組系統能夠有效介導鮑曼不動桿菌中CRISPR-Cas9造成的基因組雙鏈DNA斷裂的修復。

研究人員發現鮑曼不動桿菌自身的重組系統,以及廣泛使用的來自于大腸桿菌噬菌體的λ-Red和RecET重組系統均不能介導鮑曼不動桿菌中CRISPR-Cas9造成的基因組雙鏈DNA斷裂的修復。然而,一種來自于鮑曼不動桿菌特殊菌株IS123的RecAb重組酶系統能夠高效修復鮑曼不動桿菌中CRISPR-Cas9造成的基因組雙鏈DNA斷裂。因而,通過聯合RecAb和CRISPR-Cas9, 研究人員建立了鮑曼不動桿菌中pCasAb-pSGAb/RecAb基因組編輯平臺,在不同鮑曼不動桿菌菌株中均實現了高效且無痕的基因刪除和插入操作。同時,研究人員還基于pCasAb/pSGAb雙質粒系統,提出了一種兩步法In-Del策略,可對鮑曼不動桿菌基因組任意位點進行精確的點突變操作。通過應用In-Del策略,研究人員對OxyR蛋白活性口袋中的13個保守氨基酸執行了丙氨酸掃描突變,揭示了新的活性氧感應機理。

圖2. 基于pCasAb/pSGAb的In-Del策略及其在OxyR活性氧感應機制解析上的應用。

(A)In-Del策略的工作流程圖。(B)利用In-Del策略對OxyR活性感應口袋氨基酸的掃描突變。(C)OxyR新的活性氧感應機理。

此外,為實現耐藥質粒和可移動元件的有效編輯和進一步簡化基因編輯流程,研究人員通過融合表達胞嘧啶脫氨酶與Cas9 (D10A)切口酶,構建了單質粒pBECAb堿基編輯系統,可在鮑曼不動桿菌中執行高效的C→T轉變。應用pBECAb單質粒系統將氨基酸密碼子(CAA、CAG、CGA或TGG)轉變為提前出現的終止密碼子(TAA,TAG或TGA),研究人員對多重耐藥鮑曼不動桿菌XH386菌株的三個β-lactamase基因進行了單獨與組合失活,揭示了它們在亞胺培南與舒巴坦耐藥中發揮的具體功能。

本文第一、第二作者分別為季泉江課題組博士后王宇和研究生王志鵬,通訊作者為季泉江教授。此研究得到了浙江大學附屬邵逸夫醫院俞云松教授及其課題組成員的幫助。本論文相關研究成果已進行了專利申請(申請號:201910644444.1和201910644324.1)。該研究得到了 “生物大分子動態修飾與化學干預”重大研究計劃培育項目、上海市科委青年科技啟明星計劃等項目的支持。

值得一提的是,近年來季泉江課題組基于不同策略,已在包括金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯菌在內的多種人類主要病原菌中開發出了相應的高效基因組編輯工具,并應用這些工具和結構生物學等方法對病原菌的致病及耐藥機制,特別是過渡金屬攫取機制方面進行了深入研究。課題組開發的基因組編輯工具均可在質粒分享平臺Addgene上進行獲?。?/span>https://www.addgene.org/Quanjiang_Ji/)。

原文鏈接:https://www.cell.com/cell-chemical-biology/fulltext/S2451-9456(19)30277-6