物質學院季泉江課題組成功揭示新型Cas9核酸酶工作機理

ON2019-10-19文章來源 物質科學與技術學院CATEGORY新聞

近日,我校物質學院季泉江課題組與復旦大學甘建華課題組合作,通過晶體結構解析、細菌基因編輯以及體外DNA切割等手段,闡明了一種具有高保真和廣PAM特性的新型Cas9蛋白——xCas9蛋白的化學工作機理。該研究成果以“Molecular basis for the PAM expansion and fidelity enhancement of an evolved Cas9 nuclease”為題,在知名學術期刊《科學公共圖書館?生物學》 (PLoSBiology)上在線發表。

CRISPR基因編輯技術自被發明以來,由于其高效性和簡便性,已經被廣泛應用于醫學、生物學、化學、農學等領域的基礎和應用研究。目前最為常用的CRISPR系統為釀膿鏈球菌中的Cas9蛋白系統。它主要由一種核酸內切酶SpCas9和一種介導RNA——sgRNA所構成。SpCas9核酸內切酶能夠與sgRNA特異性結合,通過sgRNA與基因組PAM位點附近的DNA堿基互補配對,靶向識別基因組并實現基因組DNA的雙鏈斷裂。通過利用宿主細胞對雙鏈DNA斷裂的修復,研究人員能夠方便快捷地實現靶向基因編輯。但是由于CRISPR/Cas9系統識別的PAM位點的有限性以及較高的脫靶性,其在醫學和生物學等領域的深入應用受到了很大限制。

近期,科學家利用人工定向進化技術對SpCas9蛋白進行進化,開發了一種同時具有高保真和廣PAM兩大特性的新型Cas9核酸酶——xCas9,這也是目前人們開發出的唯一一種同時具有這兩大優良特性的Cas9核酸酶。但這種進化獲得的xCas9蛋白會同時具有高保真性和廣PAM這兩種特性的科學本質尚未被闡明。

在本項研究中,研究人員成功結晶并解析了xCas9蛋白與sgRNA以及帶有不同PAM位點DNA的復合物晶體結構,揭示了xCas9蛋白采用一種獨特的雙結構識別模式。在識別經典的NGG的PAM位點時,xCas9蛋白與野生型的SpCas9蛋白具有相似的空間構象;而在識別非NGG的PAM位點時,xCas9蛋白中的α螺旋識別結構域與PAM位點識別區域發生了顯著的空間結構變化。此外,研究人員還通過體外酶學活性實驗與體內堿基編輯實驗,揭示了xCas9核酸酶中引起高保真和廣PAM特性的關鍵氨基酸位點。這些研究從分子層面揭示了xCas9蛋白同時具有高保真和廣PAM兩大優異特性的化學本質,為xCas9蛋白的應用研究提供了結構支持,同時也將為其它CRISPR系統效應核酸酶的定向進化和理性設計奠定基礎。

本文第一、第二作者分別為季泉江課題組助理研究員陳未中博士和研究生張洪源,季泉江教授和復旦大學甘建華教授為共同通訊作者。上科大為第一完成單位。該研究得到了基金委優秀青年基金、“生物大分子動態修飾與化學干預”重大研究計劃培育項目、上海市科委青年科技啟明星計劃及上海光源等的大力支持。

文章鏈接:https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.3000496

圖A:xCas9蛋白與sgRNA以及靶向DNA的復合物晶體結構。

圖B:在識別不同PAM位點的DNA序列時,xCas9蛋白中的α螺旋識別結構域(REC結構域)會發生顯著的空間結構變化。

圖C:在識別不同PAM位點的DNA序列時,xCas9蛋白的PAM位點結合區域的氨基酸構象會發生顯著變化。